La Cytométrie en Flux

1/ Présentation : pourquoi a t-on mis ce procédé en place?

                 Les tissus des animaux et des plantes contiennent d'habitude un mélange de types cellulaires.  Les travaux expérimentaux exigent souvent d'utiliser une population cellulaire homogène.  Parfois, la séparation des types tire profit de caractères physiques propres à chaque type.  Les globules blancs (leucocytes) et rouges (érythrocytes) du sang diffèrent par leur densité, car les érythrocytes n'ont pas de noyau ; aussi, peut-on séparer ces cellules sur base de leur densité.  Cette discrimination avantageuse n'est pas applicable à la plupart des cellules et on a dû imaginer d'autres procédés de séparation.

              2/ Principe de cette technique :

                        Cette technique optique, appelée aussi cytométrie en flux continu est capable de reconnaître des populations de cellules isolées en suspension (organismes unicellulaires, cellules animales en culture, cellule provenant d’un tissu mais dissociées enzymatiquement, proplastes de cellules végétales...) et permet de les isoler d’un mélange. Si les cellules sont adhérentes à un support ou constituent un tissu, il est indispensable de dissocier le tissu (souvent par action d’une enzyme comme la trypsine ou la collagénase) ou de détacher  les cellules de leur support par traitement mécanique (grattage) ou enzymatique (trypsine). Cette technique est appliquée dans le trieur de cellule par fluorescence ou FACS capable de séparer une seule cellule d’un mélange de types cellulaires. Pour cela, on utilise toute propriété pouvant impliquer une fluorescence. Le principe consiste à marquer spécifiquement les cellules à sélectionner dans la population grâce à un colorant fluorescent. Par exemple, cela peut être un anticorps dirigé contre une protéine cellulaire de surface et lié à une substance fluorescente qui ira se fixer aux cellules portant cette protéine à leur surface. Ou bien, cela peut être un composé se fixant à l’ADN du noyau et responsable d’une fluorescence (BET ou DAPI). Parmi des milliers de cellule, le FACS est donc capable de sélectionner la cellule portant un marqueur déterminé ; on peut ensuite faire pousser cette cellule en milieu de culture.

          3/ Fonctionnement du trieur cellulaire :

                        En premier lieu, on incube une suspension concentrée de cellules avec un anticorps fluorescent qui se fixe à une particule ou à une molécule comme l’ADN, puis on la mélange avec un tampon qui est un fluide d’entraînement. L’appareil utilisé comporte un système injectant, sous pression. La suspension préparée circule dans une buse étroite, conçue de telle sorte que les cellules défilent une à une devant une petite fenêtre traversée par un fin faisceau laser de longueur d’onde appropriée. La quantité de lumière émise (due à la fluorescence) par les cellules marquées est analysée et mesurée par des photomultiplicateurs. En même temps, on mesure la lumière diffusée par chaque cellule qui est recueillie dans deux directions de l’espace (l’une pouvant être corrélée à la taille et la seconde à la réfringence de la cellule), permettant d’estimer leur taille et leur forme. La suspension est ensuite forcée à travers un dispositif de type vibrateur ultrasonique permettant de fractionner la veine liquide en microgouttelettes contenant au plus une seule cellule. Au moment de sa formation, la gouttelette est affectée d’une charge électrique positive, négative ou nulle, selon la nature et l’intensité du signal reçu par le détecteur optique (proportionnelle à la fluorescence). L’intérêt de cette opération est que des gouttelettes différemment chargées peuvent être plus ou moins déviées et séparées les unes des autres dans un puissant champ électrique établi entre deux plaques déflectrices : on réalise ainsi un triage cellulaire.

                       Ceci permet de récupérer dans des récipients distincts des populations cellulaires éventuellement viables, possédant des caractéristiques de fluorescence bien précises. Les gouttelettes sans charge ou portant des charges différentes ( à cause de leur teneur différente en colorant fixé) sont déviées dans un champ électrique et récupérées.

                        Une milliseconde suffit à sélectionner une gouttelette, de sorte qu’au moins 10 millions de cellules peuvent être fractionner en 1 heure.

          4/ Cytométrie en flux préparative :

                   L’appareil peut analyser les cellules selon plusieurs paramètres, et définir des « sous-populations » homogènes pour les regrouper selon des critères choisis. Chaque « sous-population » peut être séparée physiquement de l’ensemble. L’avantage de cette technique est de séparer les cellules (y compris clonage et tri de populations très rares) avec une très grande pureté en condition stérile et de ne pas les abîmer. On peut ainsi préparer le matériel biologique dont on a besoin pour d’autres analyses.

          5/ Cytométrie en flux analytique : 

                   La séparation de « sous-population » de cellules permet de calculer l’effectif, le pourcentage qu’elle représente par rapport à la population totale, la moyenne de chacun des paramètres, les écarts-standards, etc... On peut également voir si deux paramètres sont liés entre eux (coefficient de corrélation...). De plus, selon la spécificité des réactifs fluorescents utilisés pour colorer les cellules, on a accès à l’étude quantitative de nombreuses caractéristiques : présence d’antigène, quantité d’ADN ou d’ARN, viabilité, activité enzymatique. Tous ces critères peuvent être mis en corrélation. L’avantage de cette technique est de réaliser des analyses précises sur de critères très différents et très nombreux.

               6/ conclusion :

 Il existe de nombreuses applications à cette technique :

·      le dosage en ADN et en ARN

·      l’estimation de la forme et de la taille de la cellule

·      dans le cas d’un marquage des noyaux, on peut identifier, dans une population non synchrone, les cellules en fonction de leur stade dans le cycle cellulaire (G1,S,G2).

·      Aussi, l’appareil est capable de séparer en particulier des chromosomes isolés qui peuvent être classés selon leur contenu en ADN ; ceci constitue un préalable important dans les études sur le génome des cellules eucaryotes.

                 Le triage cellulaire apparaît donc comme une technique extrêmement puissante au service de la biologie cellulaire.

Références, Bibliographie